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更新时间:2024-12-09
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用途:人IL-10 ELISA试剂盒用于体外定量检测人血清,血浆,缓冲液或细胞培养液中的白介素10。此试剂盒只用于科研,不能用于诊断。
检测原理:
IL-10试剂盒应用的是夹心法固相酶联免疫吸附分析法(ELISA)。IL-10特异单克隆抗体被包被于微孔板上,已知IL-10浓度的标准品和未知浓度的样品可在此反应孔中进行检测。先将IL-10抗原和生物素标记IL-10特异单克隆抗体同时孵育。洗涤后加入亲和素过氧化物酶,孵育后洗去未结合的酶。其后加入底物,产生颜色反应,颜色的深浅与样品中IL-10的浓度成一定的比例关系。
试剂盒组成及配制:
试剂(2-8℃保存) | 1x96孔的配置 产品编号:#950.030.096 |
配制 |
96T微孔板 | 1 | 即用型(已包被) |
塑料板盖 | 2 | |
标准品:200pg/ml | 2瓶 | 按瓶上的说明稀释(见试剂制备) |
标准品稀释缓冲液(Buffer) | 1瓶(25ml) | 10x浓度,用纯水稀释。(见试剂制备) |
标准品稀释液液(Human serum) | 1瓶(7ml) | 即用型 |
对照 | 2 | 按瓶上的说明稀释(见试剂制备) |
生物素标记IL-10抗体 | 1瓶(0.4ml) | 用生物素标记抗体稀释液稀释(见试剂制备) |
生物素标记抗体稀释液 | 1瓶(7ml) | 即用型 |
亲和素-HRP | 2瓶(5ul) | 0.5ml HRP稀释液预稀释(见试剂制备,) |
HRP稀释液 | 1瓶(23ml) | 即用型 |
洗涤缓冲液 | 1瓶(10ml) | 200x,蒸馏水稀释(见试剂制备) |
TMB | 1瓶(11ml) | 即用型 |
H2SO4终止液 | 1瓶(11ml) | 即用型 |
自备材料:
蒸馏水;加样器:10ul, 50ul, 100ul, 200ul, 1000ul; 漩涡振荡器和磁力搅拌器
保存条件:
试剂盒保存于2-8度,
样品收集,处理和保存:
1. 细胞培养上清:1000xg离心10分钟去除颗粒和聚合物。
2. 血清——操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000xg离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
3. EDTA,柠檬酸盐和肝素血浆可用于检测。1000Xg离心30分钟去除颗粒。
4. 如果样品不直接使用,将其分为小部分(250-500ul)-70℃下保存,避免反复冻融。
如果可能,不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的颗粒,检测前先离心或过滤。
注意:不要在37℃或56℃加热解冻。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻
实验方案:
用前所有试剂置于常温
标准品浓度 pg/ml |
样品 | |||||||||||
A | 400 | 400 | ||||||||||
B | 200 | 200 | ||||||||||
C | 100 | 100 | ||||||||||
D | 50 | 50 | ||||||||||
E | 25 | 25 | ||||||||||
F | 12.5 | 12.5 | ||||||||||
G | 空白 | 空白 | ||||||||||
H | 对照 | 对照 |
试剂准备:
1. 洗涤缓冲液(200x)的稀释:蒸馏水200倍稀释成1X的工作液。
2. 标准品稀释液液(buffer):用前用225ml蒸馏水稀释,稀释后2-8度可保存一周。
3. 标准品的制备:
基于检测样本的不同,试剂盒提供2种不同的标准品稀释液。因为生物样本可能含有蛋白酶或细胞因子结合蛋白,可能会修饰检测的目的蛋白,请按检测的样本类型,选择合适的稀释液。
血清、血浆样本:用标准品稀释液-Human serum
细胞培养上清:用Standard Diluent Buffer
4. 按标准品瓶上的说明,加入标准品稀释液,稀释后浓度为400pg/ml。温柔上下颠倒混匀。直接在检测板上对校准品做系列稀释,浓度范围:400-12.5pg/ml。每次重新做实验,都需要重新做标准曲线。吸取200ul重悬后的标准品到A1, A2孔(400pg/ml),取100ul标准品稀释液到B1, B2, C1, C2, D1,D2, E1,E2, F1, F2孔。从A1, A2孔吸取100ul到B1, B2孔,用加样器反复吸排使其混合。小心不要擦到孔的内表面。同样从B1, B2孔吸取100ul到C1,C2;再从C1,C2到D1,D2等,从最后的两个孔(F1, F2)中吸去100ul不要。这样从A1,A2到F1,F2,IL-10标准品稀释液的浓度为400pg/ml到12.5pg/ml。也可在试管中进行此稀释,将稀释后的标准品直接加入反应孔中。
5. 对照样本的制备:
对照样本的稀释同样依据检测样本的不同选择合适的稀释液,按瓶子上标注的加入的稀释液量加入。
血清、血浆样本:用标准品稀释液-Human serum
细胞培养上清:用Standard Diluent Buffer
6. 生物素标记IL-10抗体的制备:
生物素标记抗IL-10的稀释:每次实验前准备。根据实验的孔数,以生物素标记抗体稀释液稀释。稀释量见下表。
反应孔的数量 | 生物素标记抗体(ul) | 生物素标记抗体稀释液(ul) |
16 | 40 | 1060 |
24 | 60 | 1590 |
32 | 80 | 2120 |
48 | 120 | 3180 |
96 | 240 | 6360 |
7. 亲和素-HRP的稀释:5ul 亲和素-HRP加入0.5ml HRP稀释液, 每次实验前准备,不要保存此稀释后液体。根据反应孔的数量进一步稀释,见下表。
8.
反应孔的数量 | 亲和素-HRP(ul) | 亲和素-HRP稀释液(ml) |
16 | 30 | 2 |
24 | 45 | 3 |
32 | 60 | 4 |
48 | 75 | 5 |
96 | 150 | 10 |
检测程序
使用前,将所有试剂充分混合,不要使液体产生泡沫。根据样品数量加上空白,标准品决定所需的板条,每个样品,标准品,空白和质控都应做双份。
详细步骤 | |
1 | 制备标准曲线 |
2 | 按实验方案在对应孔加入100ul样本和空白(选择合适的标准品稀释液)所有孔均做复孔。 |
3 | 用塑料膜封板,室温(18-25℃)孵育1小时 |
4 | 去掉封板膜,按以下程序洗板: a. 吸出孔内液体。 b. 每孔加入300ul1X的洗涤缓冲液 c. 吸出孔内液体 d. 重复步骤b和c两次 |
5 | 加入50ul生物素标记的IL-10抗体到各孔 |
6 | 用塑料膜封板,室温(18-25℃)孵育1小时 |
7 | 重复步骤4 |
8 | 加入100ul亲和素-HRP溶液到各孔 |
9 | 用封板膜,封板,室温(18-25℃)孵育30min |
10 | 重复步骤4 |
11 | 加入100ul即用型TMB底物溶液至各孔 |
12 | 室温避光孵育12-15min,用铝箔包住反应板, 避免光照。 |
13 | 加入100ul H2SO4终止液到各孔,终止反应。 |
在分光光度计中读取结果。450nm作为初始波长,620nm作为参考波长。 |
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