博蕾德实验技术服务指南

Western Blot 实验服务检测

样品处理及保存

1）悬浮细胞样品：

 把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入PBS轻轻吹打，1500rpm离心3min，弃去上清；反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。

2）贴壁细胞样品

• 胰酶消化：用胰酶将细胞消化后，收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入PBS轻轻吹打，1500rpm离心3min，弃去上清；反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。
• 细胞刮子收集细胞：对于某些蛋白（即对胰酶比较敏感或者实验特殊要求，如E-Cadherin不易用胰酶消化后进行WB检测），直接用细胞刮子刮下细胞，收集到EP、15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入PBS轻轻吹打，1500rpm离心3min，弃去上清；反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。

3）动物组织样品：

    取下合适的动物或者人的组织样品后用预冷的PBS或者生理盐水漂洗，尽量除尽残留血液，用滤纸把多余PBS吸取干净。把组织分成约50mg大小（依据实验目的需要进行调整），用锡纸分别包装好或者用冻存管装好，于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。

4）植物样品：

    取得待测植物样品后，用蒸馏水把泥土漂洗干净，用滤纸把多余水分吸取干净，分装成合适大小于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。

5）细菌样品：

细菌培养完成后，10000rpm离心5min收集细菌，加入PBS吹打，10000rpm离心5min，弃去上清；反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。

客户提供资料

• 新鲜或正确保存的样品：细胞＞1×10⁷；组织＞30mg；细菌湿重＞1mg；植物＞100mg；血清＞50ul等；样品蛋白浓度＞1mg/ml，蛋白量＞200ug/样品。
• 若要检测磷酸化蛋白，请在3个月内进行。长时间保存样品容易使磷酸化蛋白去磷酸化而检测不到磷酸化条带。
• 提取胞浆、胞核蛋白的样品应尽量采用新鲜样品，冻存样品提取的胞核蛋白可能会减少。
• 目的蛋白一抗，我公司可代购。
• 阳性对照样品（尽量提供）；

结果提供

• 预实验曝光结果（胶片及扫描图），预实验采取一至两个一抗稀释度；
• 正式实验曝光结果（胶片及扫描图）；
• 完整实验报告；
• OD值分析报告（可选）。

收费标准

以每张膜8个样本收费，不足8个样本按8个样本收费，欢迎询价详谈。

ELISA 实验服务检测

样品处理及保存
 1）血清：
     室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
 2）血浆：
    应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
 3）尿液：
    用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
 4）细胞培养上清：
    A、检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。
    B、检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并 放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
  5）组织标本：
    切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的细胞/组织裂解液，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

客户提供资料

• 提供液体类标本（血清、血浆、尿液、脑脊液、细胞培养上清等）和组织标本。（注：当天收集待检测的标本，储存于4℃；周期收集样本待检测的标本，保存于-70℃，避免反复冻融）。
• ELISA 试剂盒

结果提供

详细实验流程（包括标准曲线、样品的吸光值、浓度等），保证检测结果准确、客观、可信，但不能确保一定要得到某特定结果。

实验费用及时间：

根据样品数目进行报价（具体事宜请咨询）。ELISA实验一般3-5个工作日。

流式细胞术检测服务

样品制备参考：

A.     直接标记抗体（FITC标记抗体）：
(1) 收集1×10⁶个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×10⁵个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

B.     未标记抗体间接免疫荧光标记法：
(1) 收集2×10⁶个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。
(2) 用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；
(3) 用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。
(4) 加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。
(5) 加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。
(6) 加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
(7) 流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：
(1) 待测样本制成单细胞悬液，然后2000转/分离心5分钟，弃上清。
(2) 用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。
(3) 调整细胞浓度为10⁶细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
(4) PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。
注：本方法仅供参考，如有其它要求，请在送样前说明

客户提供：
1) 单个细胞：1~2×10⁶ 个细胞左右；来源于人、小鼠、大鼠或其它。

2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；来源于人、小鼠、大鼠或其它

3）抗体（荧光素标记）或检测试剂盒

结果提供：

l实验方法、步骤、所用试剂、仪器等。

流式实验数据。

实验费用及时间：

根据样品数目和检测项目进行报价（具体事宜请咨询）。流式实验一般为3-5个工作日。