人/猴抗I型胶原和II型胶原IgG抗体ELISA试剂盒

人/猴抗I型胶原和II型胶原IgG抗体ELISA试剂盒

Human/Monkey Anti-Type I and Type II Collagen IgG Antibody ELISA Kits with TMB

Catalog # Catalog # 1031T, 1032T, 1033T, 1035T, 2051T, 2052T, 2053T, and 2055T

 产品简介：

人血清，特别是自身免疫性疾病患者的血清，含有高水平的免疫成分，在ELISA检测中造成高背景。这些非特异性反应是由人血清中的粘附性免疫球蛋白引起的，这些免疫球蛋白通过亲水性结合在塑料板表面，而牛血清白蛋白（BSA）和吐温20（Tween20）也不能阻断这些非特异反应。由血清样本本身引起的假阳性反应通常被忽略。即使现在，在许多情况下也被认为是真正的抗原-抗体反应。为了获得抗原抗体反应的真实值。以下几点很关键1)选择合适的阻断剂，有效的阻断这类非特异性反应。2）用包被孔检测每个样品的背景值3）用试剂盒确定的相应值减去该背景值。此外，确定二抗的背景值也很重要。Chondrex公司的ELISA试剂盒包含*的阻断剂，可抑制这些血清成分和塑料表面的疏水性结合，并通过非包被孔测定背景值。

一般来说，人血清中的胶原对异种抗原（例如：牛或鸡I型和II型胶原）高度特异型，并且与其他种类和类型的胶原（包括人胶原）有交叉反应（与疾病无关）。例如：即使是健康正常人的血清抗体也会对不同种类和类型的胶原蛋白发生反应。为了确定血清中特定抗原的抗体水平。Chondrex公司提供各种种属的I型和II型胶原包被板和无包被板。此试剂盒提供可供2个块检测板的试剂量，可用于人和后血清样本检测。

试剂盒组分：

 包被板和设置

 标准ELSIA（Standard ELISA Kit）试剂盒（I型胶原或II型胶原单一种属）

标准ELISA试剂盒 含5列未包被的8联孔作为对照孔，用于评价样本中的背景值，5列包被了I型胶原或II型胶原的8联孔用于检测胶原抗体的含量。2列标准品。“B”代表作为空白孔，用于检测由二抗引起的非特异性反应。标准品和样本全部做复孔。

定制ELISA试剂盒（多种属胶原）

定制ELISA试剂盒用于检测人血清中的不同种属的人I型或II型胶原。此试剂盒含2列未包被孔，2列人，鸡，牛II型胶原包被板孔，和2列标准品孔。“B”代表作为空白孔，用于检测由二抗引起的非特异性反应。

用前须知：

1. 推荐标准品和样本做复孔检测。
2. 所有缓冲液用前置于室温平衡。
3. 20X洗液低温时可能会有结晶析出。如果有结晶析出，将瓶置于温育水中，直至结晶全部溶解。
4. 用移液器准确定量提供的缓冲液，提供额外的缓冲液。
5. 每个步骤结束后，用封板膜封板，防止蒸发。
6. 如果只是用部分试剂，请参照操作步骤中的用量，做相应的使用量缓冲液配制。未使用的储液在原包装管内保存，置于-20℃保存。
7. 试剂用完，做生物安全处理

操作流程：

1.加入封闭液：加100ul封闭液（Solution A）到各孔，室温孵育1小时。

2.制备标准品稀释液：未稀释的标准品储液浓度是16U/ml。在250ul的16U/ml的稀释液中加入250ul的SolutionB-8U/ml，依次制备系列标准品，4,2,1,0.5和0.25U/ml标准品。16U/ml标准品-20℃标准品-20保存，用于下次实验。

3.制备样本稀释液：血清样本10000 rpm室温离心3min 去除不容物和脂类。样本1:100稀释或用Solution B 稀释到进一步稀释。例如：取10ul样本加入0.99ml Solution B(1:100)。作为储液用于后续实验。如果可以，样本可以稀释到1:200~1:1000。

4.洗液稀释：50ml 20X稀释加入950ml双蒸水（1X稀释）。用稀释后的洗液（1X稀释）至少洗板三次。倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。

5.加入标准品和样本：加入100 ul标准品，SolutionB(空白)和样本到孔内，做复孔。室温孵育2小时。

6.洗涤：用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。

7.加入二抗：用10ml Solution C(溶液C) 溶解1管二抗。或者取一管二抗溶于50ulSolution C(溶液C)中，根据实际情况稀释。加入100ul溶解后的二抗稀释液到各孔，室温孵育1小时。

8.洗涤：用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。

9.加入HRP标记的链亲和素：取一管HRP标记的链亲和素，溶于10ml链亲和素稀释液中。

10.用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。

11.TMB:用10ml显色缓冲液稀释TMB加入100ul TMB。洗板后立即加入100ul TMB到各孔。室温孵育15min。

12.终止：加入50ul 2N 硫酸（终止液）到各孔。

13.读板：读取450nm处的OD值。如果样本OD值比大标准品的OD值还高，对样本稀释后重新检测。630nm作为副波长。

计算抗体滴度：

1.计算标准品，空白孔和检测样本的均值。

2.样本值，标准品减去空白值。注：每种抗原有对应的空白值。因此，空白孔用于各自的不同抗原。

3.从第二步，用包被孔中的OD值减去未包被孔中的样本OD值（背景值），除去非特异性反应。

4.标准品OD值做纵坐标，标准品值（U/ml）做横坐标。用log/log模式拟合曲线。图1 为例图，标准品范围0.25-16U/ml。

5.通过回归方程计算样本中抗体浓度。