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小鼠IgE抗体检测试剂盒Mouse Total IgE Kit
发布时间：2021/3/9
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小鼠总IgE抗体检测试剂盒
Mouse Total IgE (IgEa and IgEb) Detection ELISA Kit
Ca#3005
背景简介：
Ⅰ型超敏反应是一种典型的过敏性疾病，如哮喘、湿疹、花粉热、荨麻疹等。这种超敏反应是由IgE抗体介导的。IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力IgE受体（FcεRI）结合，并通过FcεRI（1）的稳定和积累显著上调FcεRI的表达，增强对过敏原的超敏反应。与细胞表面IgE抗体结合的特异性变应原交联FcεRI（2-3），引起肥大细胞的刺激和脱颗粒。这与多种促炎介质和细胞因子的释放有关，如组胺、蛋白水解酶、肝素和趋化因子，这些都会导致与I型超敏反应相关的症状。在过敏性疾病和寄生虫感染的疾病中，血清IgE抗体水平通常会升高。尽快血清IgE水平不能单独反应患者的过敏状态和临床症状，但是很明显血清IgE水平升高有助于诊断人类的这些疾病。
试剂盒组分：
组分 | 数量 | 规格 | 保存温度 |
IgE标准品（30051） | 1 | 100ng/瓶，冻干粉 | -20℃ |
捕获抗体（30052） | 1 | 0.1ml | -20℃ |
检测抗体（30053） | 1 | 冻干粉 | -20℃ |
溶液A-包被缓冲液（30054） | 1 | 10ml | -20℃ |
溶液B-样本、标准品缓冲液（30055） | 1 | 50ml | -20℃ |
溶液C-检测抗体缓冲液（30056） | 1 | 10ml | -20℃ |
溶液D-链亲和素-HRP缓冲液（9055） | 1 | 20ml | -20℃ |
链亲和素-HRP(9029) | 2 | 50ul/管 | -20℃ |
TMB 显色液（90023） | 2 | 0.2ml | -20℃ |
显色液稀释液（90022） | 1 | 10ml | -20℃ |
洗液，20X(9005) | 1 | 50ml | -20℃ |
ELISA 板 | 1 | 96孔（8x12） | -20℃ |
检测流程：
1)加入100ul 稀释后的捕获抗体到各孔。
2）4℃孵育过夜，洗板。
3）加入100ul稀释后的标准品和样本。
4）室温孵育2小时，洗板。
5）加入100ul稀释后的检测抗体。
6）室温孵育1小时，洗板。
7）加入100ul吸收后的链亲和素-HRP。
8）室温孵育1小时，洗板。
9）加入100ul TMB显色液
10）室温孵育25min
11)加入50ul终止液
12）读取450nm/630nm吸光度值
注意事项：
- 建议样本、标准品均做复孔检测
- 用前所有的缓冲液置于室温平衡
- 20X洗涤液低温可能会有结晶析出。如果有结晶析出，把洗涤液瓶置于温水中直至结晶*溶解。
- 用移液器准确定量提供的缓冲液，提供额外的缓冲液。
- 每个步骤结束后，用封板膜封板，防止蒸发。
- 如果只是用部分试剂，请参照操作步骤中的用量，做相应的使用量缓冲液配制。未使用的储液在原包装管内保存，置于-20℃保存。
- 正常小鼠总IgE水平大概在50-100ng/ml,氢氧化铝佐剂免疫2周后，抗体水平提高到ug/ml。随后用抗原免疫后增加至10-20ug/ml。
操作流程：
1.加入包被抗体：用10ml包被抗体稀释液（Solution A）稀释1管包被抗体。或者根据用量按下表稀释。加入100ul稀释后的包被抗体液到各孔，4℃过夜孵育。剩余包被抗体储液-20℃冻存用于后续实验。
板条数 | 包被抗体 | 溶液A(ml) |
2 | 17 | 1.7 |
4 | 33 | 3.3 |
6 | 50 | 5.0 |
8 | 66 | 6.6 |
10 | 82 | 8.2 |
12 | 100 | 10.0 |
2.制备标准品稀释液：推荐的标准品范围是1.6-100ng/ml。用样本/标准品稀释液（Solution）1ml稀释1管标准品（100ng/管），制备100ng/mlIgE标准品储液，随后用稀释液做系列稀释，制备：100ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.3ng/ml, 3.1ng/ml, 1.6ng/ml。剩余的标准品储液（100ng/ml）可以-20℃保存，用于后续实验。建议您每次实验室，制备新鲜标准品。
3.制备稀释样本：正常血清推荐稀释比是1:10-1:50。免疫过的小鼠血清稀释比从：1:100~1:1000，具体取决于免疫程序和血清样本收集时间。
4.洗涤缓冲液稀释：用950ml双蒸水（1x洗液）稀释50ml 20x洗液。用1x稀释洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。
5.加入标准品和样本：加入100ul标准品，SolutionB(空白)和样本到对应孔（做复孔。）室温孵育2小时。
6.洗涤：用1x稀释洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。
7.加入检测抗体：用10ml检测抗体稀释液（SolutionC）稀释1管检测抗体。或者用50ul SolutionC稀释1管检测抗体，按表格里需求量稀释。加入100ul抗体抗体稀释液到各孔，室温孵育1小时.
板条数 | 检测抗体（ul） | 溶液C(ml) |
2 | 8 | 1.7 |
4 | 17 | 3.3 |
6 | 25 | 5.0 |
8 | 33 | 6.6 |
10 | 42 | 8.2 |
12 | 50 | 10.0 |
8.洗涤：用1X稀释洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。
9.加入链霉亲和素-HRP:用10ml链霉亲和素稀释液(Solution D)稀释1管链霉亲和素-HRP。加入100ul稀释后的链霉亲和素稀释液到各孔，室温孵育1小时。
板条数 | 检测抗体（ul） | 溶液C(ml) |
2 | 8 | 1.7 |
4 | 17 | 3.3 |
6 | 25 | 5.0 |
8 | 33 | 6.6 |
10 | 42 | 8.2 |
12 | 50 | 10.0 |
10.洗涤：用1X稀释洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。
11.加入TMB:用新管制备TMB。用前10ml底物稀释液一管TMB。加入100ulTMB稀释液到各孔，室温孵育25min。
板条数 | TMB（ul） | 底物稀释液(ml) |
2 | 34 | 1.7 |
4 | 66 | 3.3 |
6 | 100 | 5.0 |
8 | 132 | 6.6 |
10 | 164 | 8.2 |
12 | 200 | 10.0 |
12.终止：加入50ul 2N硫酸（终止液）到各孔。
13.读板：读取450nm OD值。如果样本OD值大于标准品高OD值，样本稀释后重新检测。630nm波长，检测的副波长。
结果计算：
1.计算空白孔、样本和标准品OD值的平均值。
2.用标准品和样本OD均值减去空白孔OD值。
3.用标准OD值和标准品浓度值，绘制标准曲线。用Log/Log拟合曲线。见图例1.
4.通过回归曲线计算样本中浓度值，通过乘稀释倍数得到样本的原始浓度值
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