淋巴组织细胞或培养细胞表面抗原流式检测步骤

淋巴组织细胞或培养细胞表面抗原流式检测步骤 
（一）细胞样品准备 
收集组织或细胞 
1. 取出目的组织（如:脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓等），迅速浸泡在 Cell Staining Buffer 
(BioLegend Cat. #420201)中，并应用研磨及过滤等方法制备成单细胞悬液；如果为体外
培养细胞，直接用 Cell Staining Buffer 重悬细胞后进行下一步操作。 
2. 添加 Cell Staining Buffer 至约15mL，离心（350 x g）5分钟后弃去上清液。 
裂解红细胞（脾脏组织等） 
3. 如样品为脾脏组织细胞，需要裂解红细胞。把10X 红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) 
(BioLegend Cat. #420301)  用去离子水稀释成 1X工作液。然后用3 ml 红细胞裂解工作
液重悬细胞后，在冰上孵育 5分钟。 
4. 加入 10 ml Cell Staining Buffer 到管中；离心（350 x g）5分钟后弃去上清液。 
5. 重复洗涤细胞一次（步骤2）。 
6. 用 Cell Staining Buffer 重悬细胞后计数，稀释细胞为 5-10 x 106 细胞/ml，然后每支流
式检测管中加入100uL细胞悬液（5-10 x 105 细胞/管）。 
Fc受体封闭（可选） 
7. Fc受体的封闭过程是为了减少抗体的非特异性结合造成的影响；对于小鼠细胞的检测，
BioLegend 公司的纯化抗小鼠  CD16/CD32 抗体特异识别并结合 Fcγ R III/II (Cat. 
#101302, clone 93)，适用于封闭抗体非特异染色；实验操作为用 5-10 μg/ml 纯化CD16/32
抗体与细胞冰上孵育 10分钟。而对于市面上没有可用的人或大鼠封闭抗体，可以采用
加入无关纯化免疫球蛋白（如与所用荧光标记抗体相同种属和抗体亚型）到细胞样品中
进行封闭。 
（二）细胞表面荧光染色步骤 
8. 在每个流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗（荧光标记抗体、生物标记抗体或纯
化抗体）；在空白管/孔或同型对照管/孔中加入与抗体相同量的对照试剂。然后各管避
光冰浴或在4℃冰箱中孵育 15-20分钟。（注：有些抗体可能需要更长的孵育时间，建
议实验者进行预试验摸索） 
9. 加入至少 2mL Cell Staining Buffer，然后 350g离心5分钟后弃去上清液；重复洗涤过
程两次。 
10.（间接标记）若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入适量稀释好的
荧光标记二抗或荧光标记亲和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后于冰浴或在4℃
冰箱中避光孵育15-20 分钟。 
11. 重复洗涤细胞一次（按步骤 9）。 
12. 用 0.5 ml Cell Staining Buffer  重悬细胞；如有必要，加入 10uL(0.25 μg)/million 细胞
的核染料7-AAD(BioLegend Cat. #420401)以区分活、死细胞，冰上孵育3-5 分钟。（注：
我们不建议7-AAD与 PE-Cy5  或  PE-Cy7 等荧光标记抗体联用）13.上机检测并分析结
果。 
B．全血细胞表面抗原的流式检测步骤 
1.往含有100uL 抗凝全血的流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗（荧光标记抗体、
生物标记抗体或纯化抗体）。 
2. 室温避光孵育15-20分钟。（注：有些结合能力较低的抗体可能需要更长的孵育时间，
建议实验者进行预试验摸索） 
3.把10X  红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301)  用去离子水稀释
成1X工作液，用之前恢复至室温。加入2 ml  红细胞裂解工作液到含全血/一抗的检测 
 
管中，室温孵育10分钟。 
4.350g离心 5分钟后弃去上清液。 
5.加入至少2mL Cell Staining Buffer，然后 350g离心5分钟后弃去上清液。 
6.（间接标记）若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入适量稀释好的荧
光标记二抗或荧光标记亲和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后室温避光孵育15-20
分钟。 
7.重复洗涤细胞一次（按步骤 5）。 
8.用500ul Staining Buffer 或 500ul 2%的多聚甲醛固定液重悬细胞。 
9.上机检测并分析结果。