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Human sCD141 ELISA Kit
更新时间：2015-03-16
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产品名称：Human sCD141 ELISA Kit
中文名称：人cd141 ELISA 检测试剂盒
生产厂家：法国Diaclone
货号：950.720.096
Human sCD141 ELISA Kit
(中文说明书供参考，请以到货的英文说明书为准)
用途：人sCD141 ELISA试剂盒用于体外定量检测人血清，血浆，缓冲液或细胞培养液中的sCD141,试剂盒可用于检测天然和重组的人sCD141,此试剂盒只用于科研，不能用于诊断。
检测原理：
sCD141试剂盒应用的是夹心法固相酶联免疫吸附分析法（ELISA）。sCD141特异单克隆抗体被包被于微孔板上，已知sCD141浓度的标准品和未知浓度的样品可在此反应孔中进行检测。先将sCD141抗原和生物素标记sCD141特异单克隆抗体同时孵育。洗涤后加入亲和素过氧化物酶，孵育后洗去未结合的酶。其后加入底物，产生颜色反应，颜色的深浅与样品中sCD141的浓度成一定的比例关系。
试剂盒组成及配制：
试剂（2-8℃保存） | 1x96孔的配置 产品编号：#873.020.096 | 配制 |
96T微孔板 | 1 | 即用型(已包被) |
塑料板盖 | 2 | |
标准品：20ng/ml | 2瓶 | 按瓶上的说明稀释（见试剂制备，） |
标准品稀释缓冲液 | 1瓶（25ml） | 10X浓度，用纯水稀释 |
对照 | 2 | 按瓶上的说明稀释（见试剂制备，） |
生物素标记cd141抗体 | 1瓶(0.4ml) | 用生物素标记抗体稀释液稀释（见试剂制备） |
生物素标记抗体稀释液 | 1瓶(7ml) | 即用型 |
亲和素-HRP | 2支(5ul) | 0.5ml HRP稀释液预稀释（见试剂制备，） |
HRP稀释液 | 1瓶(23ml) | 即用型 |
洗涤缓冲液 | 1瓶(10ml) | 200x，蒸馏水稀释（见试剂制备） |
TMB | 1瓶(11ml) | 即用型 |
H2SO4终止液 | 1瓶(11ml) | 即用型 |
自备材料：
蒸馏水；加样器：10ul, 50ul, 100ul, 200ul, 1000ul; 漩涡振荡器和磁力搅拌器
保存条件：
试剂盒保存于2-8度，
样品收集，处理和保存：
- 细胞培养上清：1000xg离心10分钟去除颗粒和聚合物。
- 血清——操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000xg离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
- EDTA，柠檬酸盐和肝素血浆可用于检测。1000Xg离心30分钟去除颗粒。
- 如果样品不直接使用，将其分为小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免反复冻融。
如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的颗粒，检测前先离心或过滤。
注意：不要在37℃或56℃加热解冻。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻
实验方案：
用前所有试剂置于常温
标准品/对照 pg/ml | 样品 | |||||||||||
A | 20 | 20 | ||||||||||
B | 10 | 10 | ||||||||||
C | 5 | 5 | ||||||||||
D | 2.5 | 2.5 | ||||||||||
E | 1.25 | 1.25 | ||||||||||
F | 0.625 | 0.625 | ||||||||||
G | 空白 | 空白 | ||||||||||
H | 对照 | 对照 | ||||||||||
试剂准备：
- 洗涤缓冲液（200x）的稀释：蒸馏水200倍稀释成1X的工作液。
- 标准品稀释液的制备：用前加入225ml纯水，2-8度可保存一周以上。
- 标准品的制备：按标准品瓶上的说明，加入标准品稀释液，稀释后浓度为20ng/ml。温柔上下颠倒混匀。直接在检测板上对校准品做系列稀释，浓度范围：20-0.625ng/ml。每次重新做实验，都需要重新做标准曲线。吸取200ul重悬后的标准品到A1, A2孔（1000pg/ml），取100ul标准品稀释液到B1, B2, C1, C2, D1,D2, E1,E2, F1, F2孔。从A1, A2孔吸取100ul到B1, B2孔，用加样器反复吸排使其混合。小心不要擦到孔的内表面。同样从B1, B2孔吸取100ul到C1,C2；再从C1,C2到D1,D2等，从zui后的两个孔（F1, F2）中吸去100ul不要。这样从A1,A2到F1,F2，cd141标准品稀释液的浓度为20ng/ml到0.625ng/ml。也可在试管中进行此稀释，将稀释后的标准品直接加入反应孔中。
- 样品制备：在检测前，人血清或血浆样本需要用标准品稀释液1:2稀释。
- 生物素标记cd141抗体的制备：
生物素标记抗cd141的稀释：每次实验前准备。根据实验的孔数，以生物素标记抗体稀释液稀释。稀释量见下表。
反应孔的数量 | 生物素标记抗体（ul） | 生物素标记抗体稀释液（ul） |
16 | 40 | 1060 |
24 | 60 | 1590 |
32 | 80 | 2120 |
48 | 120 | 3180 |
96 | 240 | 6360 |
- 亲和素-HRP的稀释：5ul 亲和素-HRP加入0.5ml HRP稀释液, 每次实验前准备，不要保存此稀释后液体。根据反应孔的数量进一步稀释，见下表。
反应孔的数量 | 亲和素-HRP(ul) | 亲和素-HRP稀释液(ml) |
16 | 30 | 2 |
24 | 45 | 3 |
32 | 60 | 4 |
48 | 75 | 5 |
96 | 150 | 10 |
检测程序
使用前，将所有试剂充分混合，不要使液体产生泡沫。根据样品数量加上空白，标准品决定所需的板条，每个样品，标准品，空白和质控都应做双份。
详细步骤 | |
1 | 制备标准曲线 |
2 | 按实验方案在对应孔加入100ul标准品和样本,标准品，样本及空白孔,对照均做复孔。 |
3 | 加入50ul生物标记的cd141抗体到各孔 |
4 | 用塑料膜封板，室温（18-25.℃）孵育1小时。 |
5 | 去掉封板膜，按以下程序洗板：
|
6 | 加入100ul亲和素-HRP溶液到各孔 |
7 | 用封板膜，封板，室温（18-25.℃）孵育30min |
8 | 重复步骤5 |
9 | 加入100ul即用型TMB底物溶液至各孔 |
10 | 室温避光孵育10-15min，用铝箔包住反应板， 避免光照。 |
11 | 加入100ul H2SO4到各孔，终止反应。 |
在分光光度计中读取结果。450nm作为初始波长，620nm作为参考波长。 | |
注：制备的生物素标记抗cd141及亲和素-HRP应立即使用。
结果分析
以吸光度为Y轴，相应的cd141标准品浓度为X轴做标准曲线。样品的cd141含量可根据其O.D.值由标准曲线推断出来。
局限
不要在超出标准曲线检测范围，推测样本的检测值，超出检测范围的样本值不呈线性。高浓度的样品请用标准品稀释液或自备的样品稀释液稀释至标准曲线检测范围，然后样品实际测值再乘以对应的稀释倍数。
不同药物会影响检测结果。细菌或真菌及实验室交叉污染，都可导致不规律的检测数据。
不正确或不充分的洗涤都可以导致假阳性或假阴性结果。
灵敏度：
zui小的人cd141检测浓度小于0.31ng/ml。
精密度：
批内：
批间：
检测过程：（总时长1h45min）
加100ul样品或稀释标准品或对照及50ul生物素标记的cd141抗体
↓
室温孵育1h
↓
洗涤三次
↓
加入100ul亲和素-HRP
↓
室温孵育30min
↓
洗涤三次
↓
加入100ul TMB，避光显色12-15min
↓
加入100ul H2SO4
↓
|
450nm读取吸光度
