钙卫蛋白ELISA 检测试剂盒

钙卫蛋白ELISA 检测试剂盒

生产厂家：德国Immundiagnostik公司

货号： K6927

1.应用：

该试剂盒用于定量检测人粪便中的钙网蛋白含量。

2. 简介：

钙卫蛋白是一类主要由单核细胞和中性粒细胞分泌的钙结合蛋白。粪便钙卫蛋白是肿瘤及胃肠道疾病的检测标记物。临床上常常很难区分肠道易激综合征和慢性炎症肠道疾病。这就导致常常需要做大量的非必要的结肠镜检查。而钙卫蛋白可以很清楚的分辨这两种疾病。粪便钙卫蛋白与组织学及镜检检测炎症性肠病及溃疡性结肠炎以及被视为肠道疾病检测金标准的indium-111标记嗜中性粒细胞的检测结果呈显著相关性。然而，用indium-111标记嗜中性粒细胞检测肠道疾病费用成本非常高（住院费用，分析检测及同位素处理），同时患者还需要做放射性检测。由于这个原因，不推荐用这个方法用于反复检测小孩或孕妇患者。

钙卫蛋白是优于其他炎症类标记物（CRP，ESR HB）用于肠道疾病复发检测的的一个*的预测标记物。与标准的用大便潜血检测结肠癌相比，粪便钙卫蛋白检测明显占有优势。如果粪便中的钙卫蛋白含量很低，说明肠道疾病发生的概率极小。

3.试剂盒组分：

4. 试剂制备与保存：

• 如果不是单次用完试剂盒，请按试剂瓶标签上说明保存相应试剂。按照单次的使用量制备相应试剂。
• 体积少于100ul的试剂，在用前请离心。
• 洗涤缓冲液在用前用超纯水做10倍稀释（100ml储液+900ml超纯水），充分混匀。由于是高浓度的储液，在储存过程中可能会有结晶出现。如出现结晶请在室温或37℃待结晶*溶解。稀释后的缓冲液可在2-8℃保存一个月。
• 提取缓冲液在用前用超纯水1:2.5稀释（100ml IDK Extract +150ml超纯水），充分混匀。如出现结晶请在室温或37℃待结晶*溶解。稀释后的缓冲液可在2-8℃保存一个月。稀释后的缓冲液可在2-8℃保存一个月。
• 标准品和对照，需用500ul超纯水稀释。将瓶内容物至于室温溶解10min，然后轻柔上下颠倒混匀，确保充分溶解。重悬后的标准品和对照可在2-8℃保存4周。
• 其他的时间均为即用型试剂。

5. 样品制备和保存

大便样本

粪便中的钙卫蛋白在室温可保存3天。尽管这样，我们推荐粪便在2-8℃保存时间不要超过48h。长期保存，请置于-20℃保存。冰冻的粪便样本，请在分析前先置于2-8℃，然后在置于室温解冻。冰冻可导致粪便中的嗜中性粒细胞释放钙卫蛋白，因此冰冻样本相对于新鲜样本来说，钙卫蛋白含量稍高。

粪便样本中的一些添加剂，可能会对钙卫蛋白的检测起到干扰作用。因此请使用：空的离心管或试剂盒提取缓冲液加到管内。

粪便提取物

粪便提取在室温、2-8℃、-20℃均可保持稳定性9天，反复冻融不要超过3次。

粪便样本的提取：

稀释的提取缓冲液（Diluted extraction buffer IDK Extract）用作样本提取的缓冲液。我们推荐用以下方法制备粪便提取物。

Stool Sample Application System(SAS) (Cat.No.:K6998SAS)

粪便样本管：

请注意样本的稀释倍数依据粪便量及缓冲液体积决定。

用1.5ml缓冲液稀释SAS

请按照SAS说明书制备粪便样本：

1. 冰冻的粪便样本，需要先解冻。对于一些特殊的样本，需要匀浆
2. 提取样本前，在空离心管内加入1.5ml IDK Extract extraction Buffer.加入后，置于室温。
3. 打开管盖。插入量油尺后，中下部的量油尺有一凹槽，需要用粪便*覆盖。当将stick插入管内后，过多的量将溢出，而剩下15mg需要稀释的粪便样本。盖上管盖。
4. 摇动离心管，直至在凹槽没有粪便样本存在，请确保充分溶解。对于一些固体样本，样本用缓冲液浸湿10min，有利于样本检测。
5. 让样本置于管内10min，确保沉淀充分溶解，漂浮的一些类似谷类的物质，可忽略不计。
6. 轻轻的打开管盖以及量油尺的绿色的环。丢弃盖子以及量油尺，确保收集到的沉积物不再分散。

Dilution I :  1:100 稀释提取物

重悬后的样本用样本稀释缓冲液（SAMPLEBUF）1:25稀释。例如：

40 ul悬液+960ul样本稀释缓冲液=1:25(Dilution I)，zui终稀释比：1:2500

取100ul样本用于检测。

6. 检测程序：

检测原理:

试剂盒采用双抗夹心ELISA检测原理。标准品、对照和稀释的检测样本与包被的人钙卫蛋白抗体发生反应。孵育，样本中的钙卫蛋白月包被抗体发生结合。酶标的抗体加入后，形成：包被抗体-人钙卫蛋白-酶标抗体复合物。加入TMB底物显色，zui后加入终止液终止反应。显色从蓝色到黄色，颜色的深浅反应了样本中钙卫蛋白含量的高低。用标准品浓度和OD值做标准曲线，通过标准曲线和样本的OD值，计算样本中钙卫蛋白含量。

检测程序：（推荐做复孔）

1. 将样本和试剂置于室温（15-30℃）平衡。
2. 在操作流程上标记处，标准品、样本及对照所在孔位置。
3. 根据要做的样本量，选着适当数目的板条。剩余板条覆盖后，2-8℃保存。
4. 加入：标准品、样本、对照各加100ul到对应孔。
5. 覆盖版，室温孵育30min
6. 吸出孔内液体，用250ul 洗液，洗涤5次。zui后洗涤结束后，在吸水纸上排干孔内液体。
7. 加入100ul标记抗体到各孔。
8. 覆盖版，室温孵育30min
9. 吸出孔内液体，用250ul 洗液，洗涤5次。zui后洗涤结束后，在吸水纸上排干孔内液体。

10)加入100ul SUB（底物） 到各孔。

11) 避光室温孵育10-20min

12) 加入100ul终止液到各孔，充分混匀

13）读取450nm吸光度，副波长620nm ( or 690nm)。如果标准品zui高吸光度值超出了仪器检测值，请立即读取405nm吸光度，副波长620nm。

   注：颜色变化受温度影响较大，我们推荐：看到颜色差异后，终止反应。

对于一些ELISA自动化仪器，请依据仪器特点，调整检测流程。

7. 结果

以下方法用于计算检测结果。我们推荐4-参数算法。

1）4Parameter algorithm

2）Point to point calculation

3) Spline algorithm

计算结果，依据稀释倍数，样本zui终浓度需x2500。

8. 局限

样本OD超过标准品zui高OD值时，需要 样本后再测。

9.质控

需要在每次试验时，都做质控。质控值，用于评价统计方法的可行性。如果质控检测超过范围，说明样本检测值是无效的。

检测范围：

1g 粪便相当于1ml.

• 健康人群的均值为25mg/kg
• 超过50mg/kg的样本检测值，认为是阳性的。

推荐各个实验室依据自身实验，确定样本的参考值范围。

注：许多复杂的因素可导致没有炎性肠病的情况下，但是粪便中钙卫蛋白含量却升高。例如：使用非甾体抗炎药，一些间歇性的胃肠感染及一些恶性肿瘤都会导致钙卫蛋白含量却升高。

在解释实验结果及炎性肠病治疗效果评价中应考虑这些因素。

儿童粪便钙卫蛋白检测范围：

据文献：Hestvik E et al. (2011) BMC Pediatrics 11:9 doi:10.1186/1471-2431-11-9

方法：来自于坎帕拉、乌干达，0-12岁的302个健康儿童检测了粪便钙卫蛋白

表1.不同年龄段儿童粪便钙卫蛋白检测结果

文献：Fagerberg UL et al. (2003) J Pediatr Gastroenterol Nutr 37:468-472

10 试剂盒参数：

精密度

批内（n=20）

批间（n=12）

特异性：

试剂盒便于溶菌酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、乳铁蛋白发生反应。

稀释比：三个不同患者样本用样本稀释缓冲液不同吧比例稀释后分析后的结果。（n=3）

分析灵敏度：

• 不考虑稀释比为：2.099ng/ml
• 考虑稀释比为：5.2475mg/L