流式细胞仪检测方法

一、测定用乙醇固定的DNA的含量

1、培养细胞的DNA含量的测定

制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；

加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；

附:细胞固定的一般步骤

1) 取单细胞悬液1～2×10⁶个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；

2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次；

3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；

4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。在4℃条件下可保存2~3周。

注意：

² 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛；

² 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；

² 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。

² 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中；

² 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；

² 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；

² 上机检测。

2、新鲜组织的DNA含量的测定

1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；

2) 500g离心5分钟；

3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；

4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤；

5) 上机检测。

3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定

1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；

2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；

3) 加入PI液1ml室温避光30分钟；

4) 调整细胞浓度为1×10⁶/ml；

5) 上机检测。

二、细胞凋亡检测及相关分子检测

1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）

² 收集已固定的单细胞悬液约5×10⁵~1×10⁶/ml；

² 离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞;

² 1500rpm离心，5分钟 ，弃去PBS；

² 加PI染液1ml，室温避光20分钟；

² 调整细胞浓度5×10⁵/ml；

² 上机检测。

2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡

1) 常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先溶 血),取约5×10⁶个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl 1×Binding Buffer重悬；

2) 分成a、b、c、d、e五管，每管约1×10⁶个细胞

a) 阴性对照，不加任何试剂；

b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5μl,室温10min,用1×Binding Buffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μl PI避光15分钟

c) 加10μl PI，避光孵育15分钟；

d) 加5μl AnnexinV液，室温避光孵育15min；

e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室温避光孵育5min；

3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。

4) 上机检测。

注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；

b. 操作时注意避光；

c. 反应完毕后尽快检测，在一小时内检测。

3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡

1) 放置0.5~1×10⁶个细胞到试管中；

2) 室温离心200g，6min；

3) 弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；

4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min；

5) 弃上清，加入20μl PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80μl PBSF液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟；

6) 加入2ml PBSF液，室温离心200g，6min；

7) 弃上清，加入1ml PBSF液重悬细胞；

8) 避光保存，直到流式细胞仪检测。

PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。

三、用流式细胞术进行DNA周期分析

1、方法：同DNA含量检测

2、注意：

单细胞浓度应约10⁶/ml，以免影响检测的CV值和检测结果；

制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量（如细胞是否聚集或过多碎片），以保证得到足够的细胞含量；

醛类固定会影响PI与核酸的结合。

四、免疫荧光标记法

1、细胞膜上的免疫荧光检测法

间接标记法

1) 制备单细胞悬液；

2) 细胞计数，取出1×10⁶个细胞于试管中；

3) 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%；

4) 在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育30～60分钟；

5) PBS洗涤1～2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清；

6) 加入二抗，孵育20～30分钟；

7) PBS洗一次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;

8) 加300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。

直接标记法

①～③同间接标记法

④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育30分钟；

⑤用PBS洗2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;

⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。

2、 细胞膜内的免疫荧光标记法

间接免疫荧光标记法

1) 取已制备好的单细胞悬液，用1～3%的多聚甲醛固定30分钟（也可4℃保存Overnight）；

2) 用PBS洗两次，弃上清；

3) 细胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室温10分钟；

4) 用PBS洗涤两次；

5) 加入*抗体，室温30～60分钟，或4℃Overnight，同时须设阴性对照或同型对照管；

6) 用PBS洗涤两次；

7) 加入二抗（荧光标记的抗体）室温20分钟，避光；

8) 用PBS洗涤1～2次，弃上清；

9) 重悬细胞于500μlPBS中，上机检测。

直接荧光标记法

①～⑤同间接荧光标记法；

加入荧光素标记好的抗体，避光30分钟（同时做同型对照管）；

用PBS洗涤１～２次，弃上清；

加300μl PBS上机检测。

细胞膜上及细胞内双标记法（直标法）

1) 取出已制备好的未固定的单细胞悬液1×10 ⁶个细胞于试管中；

2) 用PBS洗涤两次；

3) 加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原，同时加上阴性对照管，室温孵育20分钟；

4) 在试管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分钟；

5) PBS洗涤两次1500rpm 3分钟，弃上清;

6) 打孔，加入0.1％皂素200μl室温10分钟;

7) 用PBS洗涤两次，弃上清;

8) 加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温20分钟孵育;

9) 用PBS洗一遍弃上清；

10) 用300μlPBS重悬细胞，上机检测

五、流式细胞术中的几点注意事项：

1、对照组的设置：

在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是值。如需知道值时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。

（1）、阴性对照的设置

² 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照管，作为阴性对照。

² 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为阴性对照管，实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时，同样也可同时设置“阴性细胞”的阴性对照管作为阴性对照。

² 在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。

（2）、阳性对照的设置：

在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对照设置相同。

2、几点建议：

1) 在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围内，建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准确性。

2) 建议送检细胞一定要足够量，一般要求1×10⁶个细胞。不要过少。因为，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。

3) 同一种细胞需同时做双标记时，须做双标记的同型对照，且两种抗体所标记的荧光颜色务必不同。