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Matrigel 收货注意事项,请检查:
1. 盒子内是否有干冰
2. 基质胶是否呈固态,胶面是否水平
3. 基质胶颜色是否在正常范围(黄色-粉红-深红)
产品特性 :
Martrigel基质会有色差变化(淡黄色到深红色),是由于酚红和碳酸氢盐与CO2的作用引起的,但是与5%CO2平衡后色差即会减少。
基质胶冻融操作 :
收货后,若不立刻使用基质胶,应马上将仍然是冷冻固态的基质胶放进-20℃冰箱保存。使用前须先将基质胶冻融。
冻融:
将基质胶埋于铺满碎冰的冰盒中,然后将整冰盒放入4℃冰箱溶解一夜。(普通浓度的基质胶,溶解时间1-2天;高浓度基质胶溶解时间 3-7天)。
分装:
溶解后的须分装保存,以避免反复冻融。液态基质胶,会在10℃以上快速成胶(特别是高浓度基质胶),因此,分装时,接触到基质胶的耗材必须预冷(如移液管、吸头、EP管等),并且整个实验必须无菌、冰上操作。(高浓度的基质胶比较粘稠,用移液器不好吸取,可以使用去掉针头的预冷注射器吸取。)
保存:
分装后的基质胶在冰上应仍然呈现液态,此时将基质胶放进-20℃保存即可。进行实验时,取出分装好的小管,4℃冻融。若分装好后基质胶已经凝固,说明分装操作不能很好地保持低温,导致基质胶已经成胶,不适宜使用。
普通浓度基质胶操作:
包被与成胶
细胞可在0.5mm厚度的基质胶表面生长,可以在1mm厚度的三维基质内生长。过度稀释的基质胶会形成非胶质的蛋白层,可以用于细胞贴壁,但不能用于细胞的研究分化。为保证基质胶的成胶性能与稳定,稀释浓度不应低于1:3,可用预冷无血清培养基稀释,成胶后立即使用。
薄胶成胶方法:
1.冻融后,用预冷的移液枪头混匀基质胶成匀浆状。
2. 将需要使用的培养板置于冰上,加入浓度为50ul/cm2生长面积的基质胶。
3. 在37℃放置30min,即可使用。
厚胶成胶方法
1. 冻融后,用预冷的移液枪头混匀基质胶成匀浆状。
2. 将需要使用的培养板置于冰上,将培养的细胞与基质胶混合,用移液枪头使其悬浮于基质中。加入浓度为150-200 ul/cm2生长面积的基质胶。
在37℃放置30min,可成胶。也可以加入细胞培养的基质,也可使细胞直接生长在胶表面。
薄层包被方法:
1. 冻融后,用预冷的移液枪头混匀基质胶成匀浆状。
2. 根据需要,采用无血清培养基稀释基质胶,根据实验需要确定*包被浓度。
3. 将稀释的基质胶包被与所需的培养器皿中,包被量至少覆盖整个器皿的生长表面,室温下孵育1小时。
去除未结合的基质胶,用无血清培养基轻轻地冲洗。备注:普通浓度的基质胶,建议稀释浓度不低于3mg/ml;我们不能保证稀释浓度低于3mg/ml能够成胶。
普通浓度的基质胶,不建议用于成瘤实验。
BD细胞回收剂354253,离散酶354235,冰浴7小时后回收得到细胞。
肿瘤侵袭实验:
操作过程
1. 冻融(对于预包被的24孔培养小室请参考1.1-1.3操作,对于自己包被好待用的24孔小室,请直接从步骤2开始)
1.1 从-20℃冰箱中取出产品,使其自然升温到室温。
1.2 取出培养板在细胞小室内加入500μL 37℃预热的PBS,37℃无CO2环境下孵育2小时。
1.3 解冻后,小心去除小室内的培养基,避免破坏Matrigel基质膜。
2. 染色剂后标记法
细胞通过侵袭消化基质膜后迁移到下小室,采用荧光标记定量细胞。细胞的侵袭能力用终点计算法计算得到。对于采用实时动力曲线的计算,推荐使用前标记法。
2.1 如步骤1 准备培养板。
2.2 胰酶消化细胞单层后制得细胞悬液,溶于无血清DMEM培养基,推荐浓度为5×104cells/mL。
2.3 上小室中加入500μL细胞悬液(2×104 cells)。
2.4 通过进样口在下小室中加入750μL诱导剂。
2.5 在37℃,5% CO2 条件下孵育培养板和对照板20-22小时(由细胞类型决定)。
2.6 孵育后,小心去除上小室中的培养基及基质胶,避免破坏小室的膜及膜底侵袭转移的细胞。
2.7 将培养小室转移到另一块24孔板中,结晶紫或钙黄绿素染色。计算。