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可溶性凋亡基因sCD95（APO1/Fas） ELISA 试剂盒
更新时间：2013-06-19
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sCD95（APO1/Fas） ELISA 试剂盒
用途：
人sCD95 ELISA 试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆、缓冲液或细胞培养液中的可溶性
CD95（APO-1, Fas）。本实验可以检测天然的和重组的sCD95。本试剂盒于研究，而非
用于诊断。
试验原理：
sCD95 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。抗sCD95 特异单克隆抗体包被
微孔板，已知sCD95 浓度的标准样本、对照样本和未知样本加入微孔进行检测。
先将sCD95 抗原和生物素标记的抗sCD95 特异单克隆抗体同时孵育。洗涤后，加入亲和
素过氧化物酶。再经过孵育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入酶复合物的作用底物，产生
颜色反应。颜色的深浅和样本中sCD95 的浓度呈比例关系。
提供的试剂和配制方法：
| 试剂（2~8℃保存） | 数量 | 色标 | 配制 |
| 96 微孔板 | 1 | | 即用型 |
| 塑料盖板 | 2 | | |
| 标准品：3000pg/ml | 2 支冻干粉 | 黄色 | 按标签要求以标准稀释液稀释 |
| 对照 | 2 支 | 银色 | 按标签要求以标准稀释液稀释 |
| 标准稀释缓冲液 | 1 支（25ml） | 黑色 | 10X, 用蒸馏水稀释 |
| 生物素标记抗sCD95 | 1 支（0.4ml） | 红色 | 用生物素标记抗体稀释液稀释 |
| 生物素标记抗体稀释液 | 1 支（13ml） | 红色 | 即用型 |
| 亲和素HRP | 2 支（5ul） | | 0.5mlHRP 稀释液预稀释 |
| HRP 稀释液 | 1 支（23ml） | 红色 | 即用型 |
| 洗涤液 | 1 支（10ml） | 白色 | 200X, 用蒸馏水稀释 |
| TMB | 1 支（24ml） | | 即用型 |
| 硫酸终止液 | 1 支（11ml） | 黑色 | 即用型 |
试验需要但未提供的用品：
蒸馏水
微量加样器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul
旋涡振荡器和磁力搅拌器
安全性：
仅用于科研
本试验所用的人血成分均经检测，不含有HbsAg 和抗HIV 阳性物质。尽管如此，无法
确保没有传播肝炎或艾滋病等的可能。因此处理这些血清、血浆样本时，应该遵守
有关的安全操作规程，例如CDC/NIH 健康手册：“微生物学和生物医学试验中的安全”
/1984。
→ 避免硫酸和TMB 与皮肤接触。如有接触，可用水*冲洗。
→ 不可在使用试剂盒的地方吃饭、饮水、吸烟或化妆。
→ 不可用口吸取样本。
操作要点/试验室质量控制：
1、 使用前应根据标签上指示冷藏。使用时所有试剂应平衡至室温。冻干标准品使用后
应丢弃。
2、 取出所需的孔条后，立即密封包装，以防变质。
3、 不用时所有试剂要加盖封好。
4、 不同批号的试剂不可混用。
5、 过期的试剂不可再用。
6、 使用干净的吸头来吸取各种试剂、标准品、对照或样本，以防交叉污染。吸取硫酸
或底物溶液时，避免使用带金属部分的加样器。
7、 用干净的塑料容器配备洗涤液。
8、 使用前用振荡器*混匀各种试剂。
9、 微孔内残留液须充分吸干或在吸水纸上拍干，吸水纸不可插入孔内吸水。
10、 TMB溶液是光敏的，避免长时光照。避免与金属接触产生颜色反应。
警告：TMB 有毒，避免手直接接触，并妥当处理。
11、 如配制后几分钟产生深兰色，表明TMB 溶液被污染，必须弃去。在检测完成
后一小时内必须读结果。
12、 吸取样本时，按顺序逐孔加样，以确保孵育时间相同。
13、 孵育时间见操作规程。
14、 在洗涤微孔板之后15 分钟内加入TMB 溶液。
样品收集，处理和保存
1、 细胞培养上清液——1000xg 离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
2、 血清——操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液
后，1000xg 离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
3、 血浆——EDTA，柠檬酸盐和肝素血浆可用于检测。1000Xg 离心30 分钟去除颗粒。
4、 保存——如果样品不直接使用，将其分为小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免
反复冷冻。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的颗粒，检测前
先离心或过滤。
注意：不要在37℃或56℃加热解冻。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂准备：
1、标准稀释缓冲液
蒸馏水10 倍稀释。
2、标准品
按标签要求以标准稀释液配制，其浓度为3000pg/ml sCD95，可储存。稀释前轻轻
振荡此标准品5 分钟。每次实验前将此标准品进行系列稀释，不能保存。
3、对照
按标签要求以标准稀释液配制。加样前轻轻振荡对照5 分钟。稀释后不能储存。
4、生物素标记抗sCD95 的稀释
生物素标记抗sCD95 用生物素标记抗体稀释液根据使用微孔数在干净玻璃管中
稀释。试验时准备。参见下表：
| 使用微孔数 | 生物素标记的抗体（ul） | 生物素标记抗体稀释液（ul） |
| 16 | 40 | 1060 |
| 24 | 60 | 1590 |
| 32 | 80 | 2120 |
| 48 | 120 | 3180 |
| 96 | 240 | 6360 |
5、 亲和素HRP 的稀释
在含5ul 亲和素HRP 的瓶内加入0.5ml HRP 稀释液。本液为一次性使用。
根据使用微孔数在干净玻璃管中进一步稀释。参见下表：
| 使用微孔数 | 亲和素HRP（ul） | HRP 稀释液（ml） |
| 16 | 30 | 2 |
| 24 | 45 | 3 |
| 32 | 60 | 4 |
| 48 | 75 | 5 |
| 96 | 150 | 10 |
6、 洗涤缓冲液的稀释
蒸馏水200 倍稀释。
检测方法：
1、 试剂用前充分混匀，避免产生泡沫。
2、 确定需要的微孔数，所有样本、标准品、空白和对照样本均要做双份。
3、 加100ul 配好的标准稀释液至标准孔B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2。（配制见前
述）吸取200ul 标准品加入A1,A2。（见下表）从A1,A2 中吸取100ul 至B1,B2 孔内；
反复吸排，使之混合。重复此步骤，从B1,B2 至C1,C2，然后从C1,C2 至D1,D2 等等。
sCD95 标准稀释液浓度由3000 至93.75pg/ml。从zui后的F1,F2 孔内吸取100ul 弃掉。
4、 加100ul 配好的标准稀释液至空白孔G1,G2。
5、 加100ul 样本至样本孔和100ul 对照品至对照孔H1,H2。
6、 配制生物素标记的抗sCD95。（配制见前述）
7、 加50ul 生物素标记的抗sCD95 稀释液于所有孔内。
8、 盖上微孔板，室温下（18 至25℃）孵育1 小时。
9、 洗涤微孔板：① 吸去孔内液
② 加0.3ml 洗涤液于各孔
③ 再吸去各孔内液
④ 重复②和③二次
10、 仅在用前配制HRP 液。（配制见前述）
11、 加100ulHRP 液于各孔，含空白孔。加盖。
12、 室温下孵育0.5 小时。
13、 洗涤微孔板。（见步骤9）
14、 加100ulTMB 底物液至各孔。室温下避光孵育20 至30 分钟。
15、 通常根据ELISA 阅读器确定孵育时间：许多ELISA 阅读器仅读数至2.0 O.D 值。
监察O.D 值，应在阳性结果衰褪前终止反应。（不超过20 分钟）
16、 酶底物反应用100ul 硫酸加入各孔内终止。终止反应后1 小时内（这段时间在2
至8℃避光保存）或加入硫酸后立即读取结果。
17、 用分光光度仪读数，450nm 作为初始波长，620nm（可以用610 至650nm）作为
参考波长。
建议微孔板编码：
| | 标准浓度（pg/ml） | 样本孔 | ||||||||||
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 3000 | 3000 | | | | | | | | | | |
| B | 1500 | 1500 | | | | | | | | | | |
| C | 750 | 750 | | | | | | | | | | |
| D | 375 | 375 | | | | | | | | | | |
| E | 187.5 | 187.5 | | | | | | | | | | |
| F | 93.75 | 93.75 | | | | | | | | | | |
| G | 空白 | 空白 | | | | | | | | | | |
| H | 对照 | 对照 | | | | | | | | | | |
结果分析：
制作一条标准曲线，平均光吸收值作Y 轴，对应的sCD95 浓度作X 轴。各样本中的sCD95
含量可根据样本O.D 值通过标准曲线来确定。
本试验的局限性：
超过标准曲线范围（3000pg/ml）时，不可推测结果；样本必须稀释后再检测。
本试验的检测特性：
1、 敏感性：zui小检测浓度低于47pg/ml。
2、 准确性：
| 批内 | 批间 | ||||||||
| 样本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV% | 样本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV % |
| A | 14 | 1719 | 106 | 6.1 | A | 8 | 1752 | 145 | 8.2 |
| B | 16 | 703 | 39 | 5.5 | B | 8 | 856 | 68 | 7.9 |
检测程序小结： 总时间 = 1 小时45 分钟
加100ul 样本或配好的标准品或对照
加50ul 配好的生物素标记的抗体于各孔内
室温孵育1 小时
洗3 次
加100ul 亲和素-HRP 标记物
室温孵育0.5 小时
洗3 次
加100ul TMB，避光，显色20 至30 分钟
加100ul 硫酸，终止反应
在450nm 处读取吸光度
北京博蕾德生物科技有限公司提供
注意: 请以原文说明书为准
