共焦镜同时检测细胞内Ca2+和pH的变化

关键词：显微镜检查,荧光/方法;巨噬细胞/生理学；钙/分析；酸碱平衡；小鼠

　　摘　要　目的　细胞内游离Ca²⁺与胞浆的pH在不同因素作用下可以改变。研究可以同时检测游离Ca²⁺与pH变化的方法激光扫描共聚焦显微镜观察。方法　用胞内游离Ca²⁺和pH荧光探针

　　fluo-3/AM和SNARF-1/AM标记小鼠腹腔巨噬细胞后，在激光扫描共聚焦显微镜（ACAS570）下，同时用zui适发射波长分别为530 nm和大于605 nm的检测器1和检测器2检测巨噬细胞内fluo-3/AM和SNARF-1/AM的荧光强度变化。结果　检测器1和检测器2分别只检测反映细胞内游离Ca²⁺和

　　pH变化的fluo-3/AM和SNARF-1/AM所发荧光的变化；SNARF-1/AM和fluo-3/AM所发荧光相互不影响。结论　激光扫描共聚焦显微镜可同时检测细胞内游离Ca²⁺和pH的变化。

　　中图号　R329.3

　　Simultaneous Detection of Free Cytosolic Calcium and Intracellular pH by Laser Scanning ConfocalHuang Xingxu, BaoYongyao, Huang Hui, et al.Central laboratory, First Military Medical 510515

　　microscope

　　university,

　　Abstract　Objective　Free cytosolic calcium and intracellular pH can have some changes due to certain

　　factors.It is to explore a method for simultaneous detection on the changes,that is,observation with laser scanning

　　confocal microscope.Methods　Ca²⁺-and pH-sensitive fluorescence probes of fluo-3/AM and SNARF-1/AM

　　were used to mark the peritoneal macrophages simultaneously. Then, the variations of the fluorescence were

　　detected with detector 1 （optimum emission wavelength: 530nm） and detector 2（optimum emission wavelength:＞605nm） of the laser scanning confocal microscope （ACAS570）.Results　Detector1 and 2 each detected the

　　variations of the fluorescence of fluo-3/Am or SNARF-1/AM of the Ca²⁺ or pH. The fluorescence of fluo-3/AM

　　and SNARF-1/AM did not influence each other. And the forms of the alteration in free cytosolic calcium and

　　intracellular pH of the macrophages varied when they were stimulated by different stimulators.Conclusion　Laser

　　scanning confocal microscope could be used in simultaneous detection of free cytosolic calcium and intracellular

　　pH.

　　Key words　microscopy,fluorescence/methods;macrophages/physiol;calcium/anal;acid-base equilibrium;

　　mice

　　细胞受各种因素作用时，胞内Ca²⁺和pH发生变化^〔1〕，不过由于缺乏能同时检测胞内Ca²⁺和

　　pH动态变化的方法，二者之间的关系仍不很清楚。近年来，随着激光扫描共聚焦显微镜技术和荧光探针的开发利用^〔2〕，新一代的胞内游离Ca²⁺和pH荧光探针fluo-3/AM和SNARF-1/AM被分别用于胞内游离Ca²⁺和pH变化的检测^〔3,4〕。根据fluo-3/AM和胞内游离Ca²⁺结合后在波长530 nm处荧光强度随游离Ca²⁺浓度升高而增强，而SNARF-1/AM的荧光强度在波长＞605 nm时随胞内pH升高而增强，它们的激发波长均为480 nm^〔5,6〕以及fluo-3/AM的荧光强度不受SNARF-1/AM影响^〔3〕等特点，我们设计了本实验，拟利用fluo-3/AM和SNARF-1/AM混合物同时着染巨噬细胞，以观察巨噬细胞内游离Ca²⁺和pH的动态变化。

材 料 和 方 法

　　一、主要材料

　　带双检测器的激光扫描共聚焦显微镜（ACAS570），美国Meridian公司生产。fluo-3/AM、

　　sNARF-1/AM，美国Molecular probes Inc产品。RPMI－1640、Hepes购于Sigma公司。小牛血清，浙江杭州四青生物材料厂制品。其它试剂均为分析纯。

　　二、细胞培养

　　体重20 g左右雌性正常昆明小鼠，按照鄂征等人的方法^〔7〕取腹腔巨噬细胞，以5×10⁵个/cm²的浓度接种于改装35 mm Petri细胞培养皿底部的盖玻片上，用含10％小牛血清的RPMI－1640培养于37^oC含5％CO₂的孵育箱内。

　　三、荧光探针标记

　　吸除培养皿内的培养液，用Hepes缓冲盐溶液洗三次，分别在不同培养皿中滴入10μmol/L

　　fluo-3/AM、10μmol/L sNARF-1/AM和含10μmol/L fluo-3/AM和10μmol/L sNARF-1/AM的混合液0.3 ml，37^oC孵育30～60分钟，吸除染液，用Hepes缓冲盐溶液洗3次，再加入0.5 ml Hepes缓冲盐溶液。

　　四、ACAS570检测胞内Ca²⁺和pH

　　将培养皿置于ACAS570载物台上，选用40×物镜，7％滤光片，确定激发光波长为488 nm，进入Ratio－Generic－Image scan程序，打开检测器1（zui适发射波长530 nm）和检测器2（zui适发射波长大于605 nm），建立文件，作预扫描后选定*扫描参数，对选定视野扫描并存储所获信息。主要扫描参数如下：Pinhole1 600μm, pMT1 70%, PMT2 70%, Scanning Strength 20%, Laser

　　power 10 mW。

　　五、单检Ca²⁺或pH时按张薇等人的方法^〔4〕，分别打开检测器1或2进行。

　　六、分析

　　双检分析进入Ratio－Generic－Image analysis程序，调入分析文件，得出同时反映细胞内Ca²⁺和pH动态变化的荧光强度变化曲线。单检分析进入Kinetics－Image－Analysis程序，分别调入分析文件，得出各自反映细胞内Ca²⁺或pH动态变化的荧光强度变化曲线。

结 果

　　一、细胞荧光图像

　　图1和图2分别为检测器1和检测器2同时打开时检测到的fluo-3/AM和SNARF-1/AM的细胞荧光图像。图1显示仅检测器1检测到fluo-3/AM所发荧光，同样，图2显示仅检测器2检测到SNARF-1/AM所发荧光。

　　二、单测巨噬细胞内Ca²⁺和pH的变化

　　单检结果显示，小鼠巨噬细胞未受到刺激时，fluo-3/AM和SNARF-1/AM荧光强度不变，巨噬细胞内的Ca²⁺和pH稳定；加入维拉帕米（终浓度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的荧光强度下降了0.45，SNARF-1/AM的荧光强度下降了0.2；加入肾上腺素（终浓度1μmol/L）后200 sec，

　　fluo-3/AM的荧光强度上升0.35，SNARF-1/AM荧光强度下降0.2。

　　三、双测巨噬细胞内Ca²⁺和pH的变化

　　双检结果显示，显示小鼠巨噬细胞未受到刺激时，fluo-3/AM和SNARF-1/AM荧光强度同样不变。加入维拉帕米（终浓度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的荧光强度下降了0.42，SNARF-1/AM的荧光强度下降了0.22（图3）；加入肾上腺素（终浓度1×10μmol/L）后200 s，fluo-3/AM的荧光强度上升0.36，SNARF-1/AM荧光强度下降0.21（图4）。

　　图3 归一化维拉帕米（1μmol/L）处理巨噬细胞内fluo-3/AM和SNARF-1/AM荧光强度变化曲线图,检测器1表示fluo-3/AM的荧光强度变化,检测器2表示SNARF-1/AM的荧光强度变化,标记示加样时间图4 归一化肾上腺素（1μmol/L）处理巨噬细胞内fluo-3/AM和SNARF-1/AM荧光强度变化曲线图,检测器1表示fluo-3/AM的荧光强度变化,检测器2表示SNARF-1/AM的荧光强度变化,标记示加样时间

　　图1　细胞内游离钙特异性荧光屏　flou-3/AM荧光图，检测器1可检测到fluo-3/AM的荧光，但

　　几乎未检测到任何SHARF-1/AM的荧光图2　细胞胞浆_PH特异性荧光探针SNARF-1/AM的荧光图，检测器2可检测到SNARF-1/AM的荧光，

　　但几乎未检测到任何flou-3/AM的荧光

讨 论

　　检测器1和检测器2只检测到fluo-3/AM和SNARF-1/AM的细胞荧光图像，表明检测器1和检测器2均有较严格的zui适发射波长，适合同时检测波长不同，特别是波长相差较大的荧光。而且，经维拉帕米和肾上腺素作用后，单检和双检结果显示fluo-3/AM的荧光强度变化和SNARF-1/AM的荧光强度变化均基本一致。这不仅证实了fluo-3/AM的荧光强度不受SNARF-1/AM影响^〔3〕，也反映出SNARF-1/AM的荧光强度不受fluo-3/AM影响。这些，肯定了在激光扫描共聚焦显微镜下可用荧光探针fluo-3/AM和SNARF-1/AM同时检测活细胞内游离Ca²⁺和胞浆pH的动态变化，从而为探讨细胞内游离Ca²⁺和胞浆pH之间的关系创造了条件。

　　实验结果表明,新近开发的激光扫描共聚焦显微镜技术不仅可作原位实时动态检测,具有实验过程快速, 样品处理简便, 得到数据全面等优点^〔2〕。还能显示单个细胞的荧光强度变化，将检测提高到单细胞水平。而且由于共焦镜法实现了对活细胞荧光强度变化的连续追踪，因而可准确反映细胞在加样瞬间的变化。

　　细胞内游离Ca²⁺和胞浆pH均与细胞功能相关^〔8〕。心肌细胞内游离Ca²⁺升高伴随胞浆酸化^〔9〕。

　　对巨噬细胞游离Ca²⁺及胞浆pH关系的初步研究结果显示，尽管经肾上腺素处理,巨噬细胞游离Ca²⁺及胞浆pH的变化和心肌细胞相似。但经维拉帕米作用后，巨噬细胞胞浆pH和游离Ca²⁺均降低。这表明巨噬细胞胞浆pH变化并不象心肌细胞一样由细胞内游离Ca²⁺升高引起。巨噬细胞内游离Ca²⁺和胞浆pH之间的确切关系仍需进一步探讨。

　　参 考 文 献

　　1 Hayashi H, Miyata H, Noda N, et al. Intracellular Ca²⁺ concentration and pH_i during metabolic inhibition.

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　　2 Davin MS. Confocal scanning optical microscopy and its applications for biological specimens. J Cell Science,

　　1989, 94（2）:175-206.

　　3 Rijkers GT, Justement LB, Griffioen AW, et al. Improved method for measuring intracellular Ca²⁺ with fluo-3.

　　cytometry, 1990, 11: 923-927.

　　4 张薇，朴英杰，鲍永耀，等.粘附式细胞仪测定巨噬细胞内游离钙的方法.*军医大学学报，

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　　5 Seksek O, Henry Toulme N, Sureau f, et al. SNARF-1 as an intracellular pH indicator in laser

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　　6 Richard PH, Molecular Probe. Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 5th Edition, USA,

　　1994:223-224.

　　7 鄂征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1993:185-187.

　　8 Wray S. Smooth muscle intracellular pH: Measurement, regulation, and function. Am J Physiol,

　　1988, 254C:213-225.

　　9 Daugirdas JT, Arrieta J, Ye MH, et al. Intracellular acidification associated with changes in free cytosolic